【PCR检测】病原微生物检测操作方法
点击次数：187 更新时间：2024-12-11
多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃低温退火，引物与模板互补结合。在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。经过20-30个周期后，特异的目的DNA可扩增百万倍以上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。
PCR方法操作简便，灵敏度高，可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。
【材料】
1．无菌双蒸水、石蜡油、溴化乙锭
2．10×PCR反应缓冲液
3．25mmol dNTP混合液
4．引物1，引物2各50pmol／u1
5．模板DNA
6．5U／ul Taq DNA聚合酶
【仪器】
1．PCR扩增仪
2．电泳仪
3．紫外线分析仪
【方法】
1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：
10×PCR反应缓冲液5u1
引物1 2ul
引物1 2ul
模板DNA 10u1
dNTP混合液4ul
Taq DNA聚合酶1ul
无菌双蒸水加至50ul
混匀,加50 ul石蜡油，防止样品水分蒸发。
2．将反应管置于PCR仪中，94℃变性4min。然后按94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循环35次后，72℃延伸10 min。
3．反应完成后，取l0ul PCR扩增液，加至2％琼脂糖凝胶中进行电泳，电压100V，电泳30~60min后，置紫外线分析仪下观查扩增结果。
